Introducción
⌅Los fluidos utilizados durante las labores de perforación de un pozo de petróleo, se denominan fluidos de perforación. Este término está restringido a los fluidos que se circulan a través del hoyo y cumplen con los requisitos mínimos de eficiencia, limpieza y seguridad durante la perforación de un pozo. El "fluido de perforación", incluye gas, aire, petróleo, agua y suspensión coloidal a base de agua y arcilla (Akpan et al., 2019Akpan E.U., Enyi, G, Nasr, G. Yahaya, A., Ahmadu, A. A & Saidu B. 2019. "Water-based drilling fluids for high-temperature applications and water-sensitive and dispersible shale formations." Journal of Petroleum Science and Engineering Volume 175: 1038.).
La composición o presencia de contaminantes en los cortes que se generan de la perforación dependen del fluido usado. Con una alta eficiencia del equipo de control de sólidos, es posible alcanzar una concentración de los mismos de hasta 96 %, siendo el restante 4 %, fluido de perforación adherido al corte (Chao, 2018Chao C. 2018. Proceso de estabilización química-biológica en el tratamiento de residuos sólidos de lodo base combustible diésel. Tesis presentada en opción al título de Ingeniero, Químico, Cuba: Universidad Tecnológica de La Habana "José Antonio Echeverría".).
La perforación de nuevos pozos de petróleo mediante la utilización de lodos base aceite (diésel combustible), para lograr mejores resultados en la extracción del crudo, trajo como consecuencia una serie de impactos ambientales negativos producto de la acumulación progresiva de estos cortes contaminados sin tratamiento definido para una disposición final del mismo.
Mediante una previa evaluación en microcosmos y posterior validacion en campo, se demostró la viabilidad de aplicación de un tecnologia mediante la combinación de un proceso químico - bilógico, lográndose el manejo y disposición segura de estos cortes contaminados (Romero, 2023Romero Silva R. 2023. Tecnología de tratamiento mediante la estabilización químico-biológica de cortes de perforación contaminados con lodos base combustible diésel. Tesis presentada en opción al título de Dr. C. Técnicas, Cuba: Universidad Tecnológica de La Habana "José Antonio Echeverría". ).
Durante la tecnología aplicada se realizan una serie de análisis físico-químicos; químicos y microbiológicos, que forman parte del seguimiento analítico, que permiten demostrar la disminución de la contaminación durante el tiempo de proceso transcurrido.
La aplicación de técnicas analiticas avanzadas favorece el entendimiento de dichos procesos. El limitado acceso a dichas técnicas, así como en ocasiones la no disponibilidad de material de referencia, patrones, misceláneas, entre otros, impide en muchos casos el completamiento de las investigaciones que se ejecutan.
Mediante esta investigación se pudieron realizar ensayos químicos y microbiológicos, complementados mediante técnicas de alta resolución, para un mejor entendimiento de la disminución y/o eliminación de la contaminación, corroborándose la eficiencia alcanzada por el proceso químico -bilógico validado.
Materiales y métodos
⌅Ensayos microbiológicos
⌅Se obtuvieron cepas puras mediante la siembra en medio R2A (Condalab) 25oC; 7,2+/-0,2, de veinticinco (25) cepas seleccionadas del aislamiento de bacterias resultantes del conteo de microrganismos degradadores de hidrocarburos a diferentes tiempos del proceso bilógico del tratamiento validado en campo que incio a los 30 días y hasta los 200 días, coincidiendo con el final del tratamiento (Romero, 2021Romero Silva, R. 2021. Informe final. Evaluación analítica del tratamiento de estabilización químico-biológica de cortes de perforación contaminados con lodos base diésel. Estancia de Investigación SEIGB, otrogada por la Fundación Carolina, Barcelona, España.). La siembra se realizó por el método de estrías en placas.
Para la evaluación del crecimiento microbiano en compuestos de hidrocarburos por las cepas puras obtenidas se realizó la preparación de medio mineral (M.M) minerales base (BM) y minerales trazas (TM) y M.M BM TM+ agar (Grifoll, 2021Grifoll, M. 2021. Comunicación personal. Estancia de Investigación SEIGB, Fundación Carolina, Barcelona, España.).
Los compuestos evaluados en M.M fueron el diésel y hexadecano y en M.M agarizado el fluoreno, naftaleno, fenantreno y pireno. Las placas se prepararon y sembraron en cabina de flujo laminar y la adición de los compuestos se realizó en campana de extracción. Las placas se mantuvieron a temperatura ambiente durante 15 días, las que se resguardaron en bolsas de nylon para evitar la inhalación de los gases que desprenden los compuestos evaluados.
Se realizaron experimentos de cuantificación por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS por sus siglas en inglés), marca Agilent 6890N con detector másico 5975 inert, de una cepa seleccionada que mostró crecimiento en M.M y/o M.M+agar en presencia de compuestos de hidrocarburos. A dicha cepa seleccionada se le realizó una siembra en medio R2A y se verificó que la misma fuera un cultivo puro.
En la identificación de tres cepas que mostraron crecimiento en los compuestos evaluados, se realizó la secuenciación del ARN ribosolmal16s. La extracción de ADN se realizó a cultivos jóvenes de 24 horas a los que se les comprobó la pureza mediante siembra en R2A. Se empleó como extractor IntageneChelex (BIO-RAD). La amplificación se realizó mediante una prueba de Reaccion en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés). La calidad de la PCR se comprobó mediante electroforesis. La PCR se reveló en el Image Master empleando el sistema S4BR. Se llevaron a Secuenciador Automático ABI Prism 3700. Se emplearon las bases de datos BLAST (www.blast.ncbi.nlm.nih.gov) y se observó en el RPD (Ribosomal Database Project) (Romero, 2021Romero Silva, R. 2021. Informe final. Evaluación analítica del tratamiento de estabilización químico-biológica de cortes de perforación contaminados con lodos base diésel. Estancia de Investigación SEIGB, otrogada por la Fundación Carolina, Barcelona, España.).
Ensayos quimicos
⌅A partir de las muestras correspondientes al seguimiento analítico del proceso químico-biológico desde los 0 días y hasta los 200 días de tratamiento, que se extrajeron mediante técnica inicial gravimétrica y posterior extracción por columna de compuestos saturados y aromáticos según el método EPA 3540C, se realizó la cuantificación de diésel atendiendo a la concentración estimada para la fracción de hidrocarburos saturados (F1) y la fracción de hidrocarburos aromáticos (F2). Las mismas se disolvieron en n-hexano y diclorometano respectivamente y se procedió a la mezcla de ambas. Adicionalmente se realizó la preparación del patrón de diésel con una concentración de partida de 10000 mg/kg. Del mismo se realizaron diluciones para obtener concentraciones de 5000, 2500, 1250, 625 y 312,5 mg/kg. Para el análisis se empleó un equipo de cromatografía de gases marca SHYMADZU 2025 con detector de inoizacion de llama (FID por sus siglas en inglés) . Las muestras tambien fueron analizadas por GC-MS en la determinación de hidrocarburos aromáticos policilicos (HPAs, por sus siglas en Inglés) C1-, C2- y C3- fenantrenos (m/z 192+206+220).
Resultados y discusión
⌅A continuación, se muestran cinco (5) cepas puras seleccionadas de las 10 aisladas y obtenidas en medio R2A. Se presenta una caracterización cultural de las colonias observadas al estereoscopio, tabla 1.
| Tiempo del proceso bilógico (días) | Cepas | Color | Forma | Elevación |
|---|---|---|---|---|
| 90 | 623-3(1) | Amarilla | Circular, bordes enteros | Convexa |
| 623-3(2) | Blanca | Irregular, bordes ondulados | Plana | |
| 623-5 (1) | Crema | Circular, bordes enteros | Convexa | |
| 200 | 341-1 (1) | rosada | Circular, bordes irregulares | Convexa |
| 341-2 (2) | Amarilla | Circular, bordes enteros | Convexa |
En la tabla 2, se muestran los resultados del crecimiento de bacterias en compuestos de hidrocarburos, por parte de las 5 cepas puras.
| Cepas | Diésel | Hexadecano | Naftaleno | Fluoreno | Fenantreno | Pireno |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 623-3(1) | ++ | ++ | ++ | ++ | -- | -- |
| 623-3(2) | -- | -- | ++ | ++ | -- | -- |
| 623-5 (1) | -- | ++ | -- | -- | -- | -- |
| 341-1 (1) | ++ | ++ | ++ | ++ | -- | -- |
| 341-2 (2) | -- | -- | ++ | ++ | -- | -- |
++Crecimiento ; -- No crecimiento
La cepa 623-3(1) mostró crecimiento en M.M en presencia de diésel y hexadecano y en M.M agarizado en presencia de naftaleno y fluoreno. En el caso de la cepa 623-3(2) mostró crecimiento en M.M agarizado en presencia de naftaleno y fluoreno. La cepa 341-1(1) tuvo igual comportamiento a la cepa 623-1 (1). La cepa 623-5(1) mostro crecimiento en M. M en presencia de diésel y hexadecano. Todas las cepas que mostraron crecimiento se sembraron nuevamente en R2A comprobando que las mismas eran cultivos puros y que no existió contaminación durante la experimentación desarrollada.
A continuación se relacionan los resultados de la evaluación en la degradación de diésel por parte de la cepa 623-3 (1), mediante el experimento de cuantificación por CG-MS. En las figuras 1, 2 y 3 se representan los perfiles cualitativos correspondientes a los cromatagramas obtenidos para las tres réplicas evaluadas e igual número de réplicas de un control.
Como se puede observar en las figuras 1, 2 y 3, los cromatogramas muestran un incremento de la curva UCM (mezcla de compuestos no resueltos) de las muestras con respecto a los controles, lo que indica que ha existido degradación de diésel por la cepa evaluada. Esta degradación se corresponde con la disminución de hidrocarburos alifáticos de n-alcanos de 14 a 29 átomos de carbono (n-C14 a n-C29).
En la tabla 3 se muestra la cuantificación de las relaciones de áreas de n-C17/ Pristano y n-C18/ Fitano, evidenciando una reducción de las cadenas parafínicas C17 y C18 respecto a compuestos isoprenoides pristano y fitano de las muestras y réplicas correspondiente a la cepa evaluada con respecto a los controles.
| Muestra (M) Control (C) | n-C17/ Pristano | n-C18/ Fitano |
|---|---|---|
| M-1 | 1.84 | 2.91 |
| C-1 | 9.58 | 5.10 |
| M-2 | 1.43 | 2.34 |
| C-2 | 9.76 | 4.11 |
| M-3 | 1.72 | 2.84 |
| C-3 | 9.44 | 4.23 |
Al comparar las relaciones C17/ Pristano y n-C18/ Fitano entre muestras y control, se observa que los valores disminuyen aproximadamente en un 80 y 60 % para cada relación respectivamente. Esta disminución de los isoprenoides indica la efectividad de la biodegradación acontecida.
En el siguiente esquema se presentan los resultados de la secuenciación del ARN ribosolmal 16s de las cepas 341-2 (2) (1), 623-3(1)-(2) 341-1 (1)-(3) .
Los resultados arrojaron que la cepa 341-2 (2) se identifica como Actinobacterias, la cepa 623-3(1) como Shingomona Paucimobilis y la 341-1(1) es de dominio Archea.
Las Actinobacterias o actinomicetos pertenecen a la clase de bacterias Gram positivas, estas se encuentran en los suelos e incluyen algunas de las más típicas formas de vidas terrestres, jugando un importante papel en la descomposición de materia orgánica. Estas bacterias presentan una elevada versatilidad metabólica, siendo capaces de utilizar un amplio espectro de HAPs e incluso otros contaminantes, como por ejemplo los alcanos (Izquierdo, 2013Izquierdo Romero A. R. 2013. Biodegradacion de HAPs durante la biorremediación aerobia de suelos contaminados con hidrocarburos del petróleo. Análisis de poblaciones bacterianas y genes funcionales. Tesis presentada para optar por el título de Doctor de la Universitat de Barcelona. ).
Las Shingomonas son bacterias Gram negativas. Estas presentan características filogenéticas, ecológicas y fisiológicas diversas. Por tal motivo son llamadas por cuatro géneros que se denominan esfingomonas. Las esfingomonas se encuentran distribuidas extensamente en la naturaleza. Debido a sus capacidades biodegradantes y biosinteticas se han utilizado en diversas aplicaciones biotecnológicas, como la biorremediacion de contaminantes ambientales (Bourne et al., 2001Bourne, David G. Riddles, Peter, Jones, Gary J, Smith, Wendy & Blakeley, Robert. L2001. Characterization of a gene cluster invoved in bacterial degradation of the cyanobacterial toxin microcystin LR. Enviroment Toxicology (en frances) 16 (6): 523-534. ISSN 1522-7278. Doi 10.1002/tox.10013 . [ Consultado: Septiembre 4, 2019].). La capacidad catabólica de degradar distintos compuestos xenobióticos por las Shingomonas es amplia, y se conoce de la gran variedad de exopolisacáridos que producen, lo cuales podrían ser utilizados para la degradación de distintos compuestos. Algunos miembros de su género se han caracterizado por su gran habilidad para degradar HAPs entre otros (Montoya, 2017Montoya Sanchez L A. 2017. Capacidad de degradación xenobiótica por microorganismos de suelos arroceros tratatado con el plaguicidas en el tolima. Tesis presentada para optar por el título de biólogo, IBAGUE:Universidad del Tolima. ).
El dominio Archea está compuesto por organismos procariotas unicelulares muy similares y al mismo tiempo muy diferentes a las bacterias. Por tal motivo, se recomienda realizar un posterior análisis de este organismo unicelular, atendiendo a su presencia y los resultados acontecidos para este en el accionar del tratamiento evaluado.
En las figuras 4, 5, 6 y 7 se muestran los cromatogramas obtenidos del análisis por cromatografía gaseosa (CG) con detector FID de los extractos orgánicos de la mezcla de compuestos saturados y aromáticos (F1 y F2), correspondientes a diferentes tiempos de análisis del tratamiento (tabla 4).
Como se aprecia en los cromatogramas obtenidos, existe una disminución cualitativa asociada a la intensidad de los mismos al inicio del tratamiento y con el PQ y posteriormente el PB. Al finalizar el tratamiento la intensidad es menor a toda la alcanzada para los diferentes tiempos monitoreados, lo que indica la degradación ocurrida de los compuestos de hidrocarburos saturados y aromáticos.
En la tabla 5 se muestran los valores correspondientes a las áreas asociadas de los cromatogramas obtenidos de las muestras y de un patrón de diésel a las diferentes concentraciones evaluadas. Esta experimentación permitió determinar el contenido de diésel que fue posible disminuir en los cortes contaminados durante el tratamiento.
| Muestra | Áreas |
|---|---|
| 542 F1 y F2 | 4095467,2 |
| 543 F1 y F2 | 3276965,1 |
| 600 F1 y F2 | 3220127,6 |
| 154 F1y F2 | 1803409,1 |
| Patrón a 5000 (mg/kg) | 37391695,5 |
| Patrón a 2500 (mg/kg) | 16624599,8 |
| Patrón a 1200 (mg/kg) | 8847826,6 |
| Patrón a 600 (mg/kg) | 5190391,8 |
| Patrón 300 (mg/kg) | 4310929,2 |
Para determinar las concentraciones en que se encuentra el diésel en las muestras analizadas se utilizó un gráfico de concentración del patrón en función del área. De la ecuación de la recta de la curva obtenida (figura 8), se calcula la concentración que tiene cada muestra analizada a los diferentes tiempos del tratamiento ejecutado.
En la siguiente tabla 6 se reflejan las concentraciones calculadas de las muestras analizadas. Se evidencia la disminución de diésel de los cortes tratados durante el seguimiento de ambos procesos y hasta finalizar el tratamiento.
| Muestra | Concentración | ||
|---|---|---|---|
| ppm | ug aceite | ug/g Suelo | |
| 542_F1 y F2 | 487,0 | 4869,9 | 487,0 |
| 543_F1 y F2 | 372,6 | 3725,8 | 372,6 |
| 600_F1 y F2 | 364,6 | 3646,4 | 364,6 |
| 154_F1y F2 | 166,6 | 1666,2 | 166,6 |
En la tabla 7 se muestran las relaciones n-C17/Pristano y n-C18/Fitano evidenciando de manera general una reducción de las cadenas parafínicas C17 y C18 respecto a compuestos isoprenoides pristano y fitano determinados durante el proceso y en comparación con la culminación de este.
| Muestra | n-C17/Pristano | n-C18/Fitano |
|---|---|---|
| 542_F1 y F2 | 1.563 | 1.459 |
| 543_F1 y F2 | 1.644 | 1.411 |
| 600_F1 y F2 | 1.514 | 1.562 |
| 154_F1y F2 | 1.214 | 0.859 |
A continuación, se muestran los resultados obtenidos por CG-MS en la determinacion de los HPAs C1-P, C2-P y C3-P, fenantrenos (m/z 192+206+220) de la muestra No. 542 correspondiente al inicio del tratamiento (figura 9) y dimetil-fenantrenos (198+212+226) de la muestra 154 al final del tratamiento (figura 10).
Se observa en el cromatograma de la muestra No. 154 correspondiente al final del proceso, una disminución de los dimetil-fenantrenos (C2-DBT), encontrándose estos por debajo de los trimetil-fenantrenos (C3-DBT). Adicionalmente, se aprecia la perdida de los mono-fenantrenos (C1-DBT) al no existir presencia de estos al final del tratamiento. Estos resultados corroboran la biodegradación ocurrida para estos compuestos por la aplicación del tratamiento y la eficiencia alcanzada por este.
Conclusiones
⌅Cinco cepas puras aisladas mostraron crecimiento en compuestos de hidrocarburos. Se constató la degradación de diésel por parte de la cepa 623-3 (1), identificada como Shingomona Paucimobilis, mediante la disminución de hidrocarburos alifáticos de n-alcanos de 14 a 29 átomos de carbono. La cepa 341-2(2) se identifica como Actinobacterias. Ambas mostraron crecimiento en todos los compuestos de hidrocarburos evaluados, presentando una elevada versatilidad metabólica, siendo capaces de degradar un amplio espectro de compuestos del petróleo, entre ellos los HAPs según la literatura especializada. Los análisis químicos confirman la degradación de diésel de la experimentación y cuantificación realizada desde el inicio del tratamiento ascendente a 487,0 ug/g suelo y de 166 ug/g suelo al finalizar el tratamiento. Esta degradación se constató con la disminución acontecida para los compuestos dimetil-fenantrenos con respecto a los trimetil-fenantrenos y la no presencia de mono-fenantrenos, en comparación con el inicio y final del tratamiento.